Protein Identification from Two-dimensional Gel Electrophoresis Based on Peptide Mass Fingerprinting (PMF) Using a Benchtop MALDI-TOF Mass Spectrometer
Atualmente, técnicas proteômicas shotgun usando espectrometria de massa por cromatografia líquida são utilizadas principalmente como métodos de alto rendimento para identificar muitas proteínas diferentes no citoplasma celular. No entanto, estas técnicas não são necessariamente eficazes para identificar todas as proteínas. Em particular, ao manusear proteínas separadas por meio de eletroforese bidimensional, etc., os pontos de proteína detectados no gel de eletroforese devem estar ligados aos resultados da identificação de proteínas. Para tais análises, pode haver muitos casos em que o uso da espectrometria de massa MALDI-TOF é mais eficiente do que o uso da espectrometria de massa por cromatografia líquida após o tratamento enzimático dos pontos de proteína separados do gel. Este artigo apresenta um exemplo de identificação de proteínas usando eletroforese bidimensional e um espectrômetro de massa MALDI-TOF de bancada.
Eletroforese Bidimensional de Proteínas Séricas
0,5 μL de soro humano foram diluídos em 100 μL de água. Após adição da solução de metanol/clorofórmio/água (3:1:4), a solução total foi centrifugada para extrair proteínas. Em seguida, as proteínas extraídas foram limpas com metanol e deixadas para secar. Uma solução tampão para eletroforese bidimensional (Swelling Buffer, SHARP) foi misturada com agentes redutores e anfólitos e adicionada às proteínas para realizar eletroforese bidimensional usando Auto2D (SHARP). A eletroforese da primeira e segunda dimensões foi realizada durante pouco menos de duas horas. O gel resultante da eletroforese foi corado com CBB (InstantBlue, Expedeon Ltd.) para detectar manchas proteicas (Fig. 1).
Fig.1Imagem de gel de eletroforese bidimensional de círculos vermelhos de proteína sérica humana: pontos separados
MALDI-TOF MS de bancada "MALDI-8020"
Características principais:
- Modo linear (íon positivo) MALDI-TOF;
-Laser de estado sólido de 200 Hz, 355 nm;
-Câmara Load-lock para introdução rápida de amostras;
-Limpeza de fonte baseada em laser UV (patenteada);
-Design de bancada/pequeno tamanho;
-Operação silenciosa (<55 dB)