Intact Proteins
| CQAs observáveis ao nível da proteína intacta | Método Analítico |
|---|---|
| Aggregation, dimerization | Cromatografia de exclusão |
| Desamidação, piroglutaminação | Análise de variante de carga (IEX) |
| Embaralhamento de ligações dissulfeto | Aferição de Peso Molecular(LC-MS) |
| Principais glicoformas | |
| Conjugação de drogas | Cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) |
A medição precisa da massa ajuda a determinar se a sequência correta da proteína foi expressa com as modificações pós-traducionais (PTMs) esperadas. Também fornece abundância relativa de diferentes proteínas ou PTMs presentes na mesma amostra. Um espectrômetro de massa de alta resolução e alta sensibilidade facilitará esta análise. A Shimadzu oferece a melhor solução para uma análise rotineira de massa precisa de alta resolução com o espectrômetro de massa de tempo de voo quadrupolo LCMS-9030 (Q-TOF LC-MS). Ele mantém sua precisão de massa por dias sem exigir recalibração ou usar padrão interno
Sistema LCMS-9030 Q-TOF
Análise de Agregados e Fragmentos
Sabe-se que os agregados proteicos induzem fortemente a respostas imunogenicas quando administrados, e a agregação é um dos atributos de qualidade mais importantes que deve ser monitorizado e gerido em cada passo do desenvolvimento e refinamento do processo. Por exemplo, na fase inicial de desenvolvimento, as linhas celulares que têm maior tendência para produzir agregados ou degradantes são novamente eliminadas, mesmo que apresentem um elevado rendimento de secreção. A cromatografia de exclusão molecular é o método de escolha para separar a fração monomérica principal das variantes de tamanho que ocorrem por agregação ou degradação. A Shimadzu fornece uma variedade de colunas de exclusão molecular que são úteis principalmente para aumentar o rendimento necessário para a análise de triagem
Cromatografia de exclusão molecular de mAb
Coluna: shim-Pack Bio Diol-300
Fluxo: 0.2 mL/min
Amostra:Anticorpo monoclonal humanizado lgG1
Aqui, os cromatogramas comparam o perfil de separação em colunas de exclusão molecular do mAb adquirido pelas colunas Shim-pack Bio Diol-300 de diferentes dimensões a uma taxa de fluxo constante. A redução do tamanho das partículas (5μm a 2μm) resultou no aumento da resolução do pico, o que por sua vez deu espaço para reduzir o tempo de análise usando uma coluna mais curta (30 minutos a 15 minutos).
| Coluna | N (3) | Rs (1,2) | Rs (2,3) |
|---|---|---|---|
| (1) 5μm, 300×4.6mm | 8,500 | 0.88 | 2.67 |
| (2) 2μm, 300×4.6mm | 16,200 | 1.17 | 4.15 |
| (3) 2μm, 150×4.6mm | 8,700 | 0.85 | 2.75 |
Série Bio Shim-pack
Análise de Variante de Carga
A modificação, isomerização ou clivagem que ocorre num resíduo de aminoácido carregado altera a carga global da proteína, afectando a sua estrutura, afinidade de ligação e estabilidade. Portanto, a heterogeneidade relacionada à carga é um importante atributo de qualidade do mAb. O perfil das variantes de carga pode ser avaliado por cromatografia de troca iônica (IEX), e isso é monitorado repetidamente durante todo o fluxo de trabalho de desenvolvimento. A repetibilidade do perfil de eluição depende fortemente da robustez do sistema HPLC para manter a precisão e a exatidão na presença de sais fortes necessário para IEX.
Aqui, a amostra de mAb foi separada por cromatografia de troca catiônica e a repetibilidade de 10 injeções consecutivas foi avaliada. Os resultados mostrados demonstram que o sistema sustenta com precisão a linha de base e o perfil de eluição na presença de NaCl 0,2 M.
Cromatografia de troca catiônica de mAb
Sistema HPLC : Prominence-i
Fase Móvel: 0.02 M de fosfato de sódio e 0.2 M NaCl
Fluxo : 1.0 mL/min
Amostra: mAb (Trastuzumab)