Purificação
Os fármacos de ácidos nucleicos, tais como os oligonucleótidos anti-sentido, exercem a sua eficácia interagindo com genes alvo dentro e fora das células. Ao contrário dos medicamentos convencionais de pequenas moléculas, são capazes de atacar as causas das doenças a nível genético e estão a atrair a atenção como medicamentos de próxima geração. Os medicamentos de ácido nucleico são produzidos principalmente através de síntese química, mas o processo de síntese também produz muitas impurezas, como componentes de comprimento mais curto e grupos protetores, portanto, é necessária a separação e purificação adequadas do oligonucleotídeo alvo.
Análise de oligonucleotídeos por Cromatografia de Troca Iônica (IEX)
Neste artigo, apresentamos um método analítico para a separação de oligonucleotídeos de diferentes comprimentos por cromatografia de troca iônica, assumindo que componentes de menor comprimento são impurezas derivadas do processo de síntese.
Para obter desempenhos analíticos ideais, foi utilizado um sistema HPLC inerte. O inerte Nexera XS, projetado para suprimir a adsorção de compostos de coordenação de metais contendo grupos fosfato.
- A sequência do oligonucleotídeo a ser analisado é mostrada na Tabela 1. Os oligonucleotídeos alvo em 20 mer e 4 sequências que foram deletadas de n-1 a n-4 no terminal 3' do alvo foram preparados como impurezas derivadas da síntese. Todos eles eram DNA de fita simples não modificado e sintetizados por síntese em fase sólida (purificação por HPLC). Estas 5 sequências foram diluídas para 5 μmol/L com água e uma mistura de oligonucleotídeos foi preparada.
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Table 1 Oligonucleotides
Sequence (5' ---> 3') Length (mer) 1 TCTTGGTTACATGAAA 16 2 TCTTGGTTACATGAAAT
17 3 TCTTGGTTACATGAAATC 18 4 TCTTGGTTACATGAAATCC 19 5 TCTTGGTTACATGAAATCCC 20
Figura 1 Cromatograma da mistura de oligonucleotídeos
Na cromatografia de troca iônica, esse paration é baseado no número de grupos fosfato no oligonucleotídeo, ou seja, na diferença na carga negativa. Portanto, geralmente, os oligonucleotídeos mais curtos eluem primeiro. A Figura 1 mostra um cromatograma de uma mistura de oligonucleotídeos de cinco sequências. Cada oligonucleotídeo foi separado pelo seu comprimento.
Figura 2 Cromatogramas da mistura de oligonucleotídeos contendo impurezas
Uma mistura de cinco oligonucleotídeos, na concentração de 5 μmol/L cada, foi preparada (quatro deles foram purificados por HPLC enquanto 1 foi apenas dessalinizado) e comparada com a mistura de todos os nucleotídeos purificados por HPLC (Figura 2). Os oligonucleótidos alvo foram completamente separados de impurezas, tais como grupos protectores livres e oligonucleótidos de comprimento mais curto.
Quando os oligonucleótidos são analisados utilizando cromatografia de troca iónica, as amostras são separadas e eluídas utilizando um gradiente de concentração salina. No caso de uma fase móvel com pH elevado (básico), a absorção de dióxido de carbono do ar pode alterar o nível de pH. Para cromatografia de troca iônica, mesmo quando a mudança de luz no pH pode ter um impacto significativo nos resultados analíticos (o mecanismo de separação é baseado na diferença de carga dos analitos). Por esta razão, é importante evitar quaisquer alterações no pH das fases móveis, a fim de obter desempenhos analíticos estáveis. Neste artigo, também é relatado o efeito das alterações no pH da fase móvel nos resultados analíticos.