Cromatógrafo Líquido Prominence nano Nanoflow

Primeiro, quais são seus motivos para usar um sistema LC/MS e como você decide se deve usar nano-LC (Prominence nano) ou micro-LC?

Usamos o sistema para analisar proteomas e peptídeos, ou devo dizer peptidomas. Das duas unidades Shimadzu LC que temos, uma é usada como um sistema de nanoescala e a outra como um sistema de microescala. É mais uma consideração do MS, mas usamos nano-LC para unidades MS com eletrospray estável em baixas taxas de fluxo e micro-LC para unidades MS que precisam ser operadas em taxas de fluxo em microescala. O sistema LC/MS com a unidade nano-LC é usado para qualificação e quantificação relativa usando reagentes codificados por isótopos. O sistema micro-LC/MS é usado para análise quantitativa quando queremos medir amostras com taxa de fluxo e condições de pulverização mais estáveis.

Quais foram seus motivos para comprar o Prominence nano e quais eram suas expectativas antes de comprar o sistema?

A razão pela qual compramos o sistema foi porque estávamos envolvidos com o Prominence nano antes de seu lançamento e o produto final incorporou nossas necessidades. Nosso pedido era que a adsorção não específica ao sistema fosse evitada o máximo possível, o que é diferente do transporte. Pedimos que a adsorção fosse mantida o mais baixa possível nas válvulas e no amostrador automático e que as linhas de fluxo fossem mantidas o mais curtas possível. O uso de tubos mais estreitos pode levar a problemas de entupimento, por isso pedimos linhas de fluxo que forneçam um fluxo estável sem entupimento. Agora quase não temos problemas com entupimento, então podemos realizar medições consecutivas sem preocupação.

Presumo que você esteja lidando com amostras e fases móveis com muito cuidado, mas você as mantém fluindo continuamente?

Sim, nós os mantemos fluindo continuamente. Isso garante fluxo estável com adsorção mínima, o que fornece sensibilidade confiável. Existem várias maneiras de reduzir o transporte, como o enxágue, mas o enxágue implica que há algo aderido às linhas, portanto, não fornece uma solução adequada ao detectar vestígios de amostras. Portanto, sempre nos esforçamos para evitar qualquer adsorção em primeiro lugar, o que presumivelmente está indo bem. Isso vale para sistemas nano e micro. Também temos o cuidado de comparar os sistemas atuais com os sistemas anteriores. Os sistemas Shimadzu têm maior sensibilidade e gradientes mais estáveis. No entanto, os outros instrumentos que temos não são os modelos mais recentes, portanto, não incluem feedback de fluxo.

Muito obrigado. Quais condições analíticas você usa principalmente?

Para nano-LC, usamos uma taxa de fluxo de 200 nL/min, enquanto para micro-LC, usamos 2 μL/min. Usamos colunas monolíticas para ambos. Colunas de trap também são instaladas. Usamos o sistema nano-LC (Prominence nano) como um sistema 2D, por isso instalamos uma coluna de troca iônica personalizada.

Como você decide quando usar 1D e quando usar 2D?

2D é usado para amostras extremamente complicadas ou amostras codificadas por isótopos. 1D é usado para medir quantidades vestigiais em amostras relativamente simples ou para analisar uma única proteína em detalhes. Nossos parâmetros de buffer são personalizados e usam pontas de nebulizador MS que nós mesmos fabricamos. A unidade LC é durável, quase sem manutenção e pode ser operada por longos períodos, economizando mão de obra. Usando um pulverizador de metal, as medições podem ser realizadas quase sem parar, o que também é mais fácil psicologicamente. É preciso muito trabalho extra se parar no meio do caminho. Entendo que muitas pessoas usam 1D para a maior parte de seu trabalho e, se 2D for necessário, elas usam cromatografia de troca iônica ou outros métodos para fracionar a amostra off-line e, em seguida, medem as frações com 1D LC/MS. Isso pode fornecer uma resolução melhor, mas para aplicativos como o nosso, em que estamos elevando o nível de desempenho usando nano-LC 2D, um sistema automatizado com desempenho confiável é mais importante. O Prominence nano realmente reduziu a quantidade de trabalho necessária.

Eu verificarei e estou muito feliz em ouvir isso.

A unidade MS deve ser calibrada de tempos em tempos, mas podemos medir o dia e a noite, por dias seguidos. Por exemplo, frequentemente realizamos essas medições contínuas durante o feriado de Ano Novo. Medições 2D podem ser especialmente boas em nosso caso, porque adquirimos e analisamos amostras biológicas. O entupimento durante a primeira dimensão é bastante incomum, devido à grande escala da coluna. Se começássemos com escala nano, a menor coisa poderia causar entupimento.

Você tende a realizar mais medições 2D?

Ultimamente, estamos fazendo principalmente 2D. Ocasionalmente, mudamos para 1D e medimos uma amostra padrão para verificar o nível de desempenho para fins de manutenção.

Quais vantagens ou desvantagens você acha que o nano-LC oferece em comparação com o micro-LC?

Provavelmente, a maior vantagem do nano-LC é que ele usa quantidades de amostra tão pequenas e fornece alta sensibilidade. Ele também usa menos solvente. Na verdade, não houve um problema recentemente com acetonitrila? De qualquer forma, quanto menores as quantidades consumidas, melhor. Em termos de desvantagens, uma é provavelmente a confiabilidade dos sistemas. Temos usado uma variedade de sistemas LC desde que introduzimos um sistema LC capilar em 1995, mas o maior problema tem sido entupimento, parada e taxa de fluxo reduzida. No entanto, agora que o sistema nano Prominence resolveu esses problemas, o sistema Shimadzu atual oferece o máximo em confiabilidade. Até mesmo a disponibilidade limitada em tipos de coluna pode ser resolvida por meio da personalização. A única desvantagem remanescente é sua capacidade quantitativa. Isso se aplica não apenas à unidade LC, mas também com problemas de capacidade quantitativa para a unidade de pulverização MS. É uma questão difícil, pois nossa posição é usar micro-LC para quantificação, em vez de nano-LC. Os principais fatores para uma boa quantificação são uma taxa de fluxo estável e pulverização. Portanto, pensamos que o micro-LC usando um sistema de HPLC com capacidade de nano-LC pode atender a esses requisitos. No futuro, acreditamos que a importância da análise quantitativa continuará crescendo, mesmo no campo da proteômica.

Como é a reprodutibilidade da injeção e reprodutibilidade do tempo de retenção do Prominence nano?

A reprodutibilidade do tempo de retenção é muito boa. Não tenho certeza sobre a reprodutibilidade da injeção, porque nunca realizamos um estudo para verificá-la com precisão. Nosso trabalho é principalmente qualitativo; mesmo quando é quantitativo, envolve quantificação relativa usando codificação de isótopos. Então, atualmente, não estamos muito preocupados com a reprodutibilidade da injeção. No entanto, em nossa empresa, até mesmo injeções de um microlitro são realizadas com precisão e a reprodutibilidade da intensidade de íons em cromatogramas é boa, portanto, é improvável que seja um problema. Pretendemos avaliar a reprodutibilidade da injeção no futuro, quando começarmos a fazer análises mais quantitativas.

Quais funções você acha que deveriam ser adicionadas ou o desempenho melhorado?

Dada a forma atual de HPLC, provavelmente a única coisa a acrescentar é maior velocidade.

Você quer dizer alta velocidade e alta capacidade de separação? Não é um problema para a bomba em si, mas é bastante difícil no que diz respeito às linhas de fluxo. Atualmente, usamos tubos capilares de sílica fundida de 360 mm com juntas de manga, mas esse parece ser o gargalo. É tudo sobre como aumentar a velocidade sem sacrificar a capacidade de resolução, mas quanto mais velocidade você tem em mente?

Como o 2D leva muito tempo, quanto mais rápido, melhor. No entanto, isso também envolveria velocidade de varredura no lado do MS. Mesmo que o tempo de medição atual de 60 minutos permanecesse em 60 minutos, se fosse possível separar componentes que anteriormente não podiam ser separados, isso seria extremamente emocionante.

Eu verificarei e estudaremos a questão, incluindo o tipo de materiais utilizados.

Você tem algum comentário sobre o LCsolution e seu software de controle Nano-Assist dedicado?

Como o LCsolution parece mais adequado para alternar entre análises 1D e 2D, não usamos muito o Nano-Assist. Uma coisa que notamos sobre o uso do LCsolution para análise 2D é que, se o tempo para uma dimensão for alterado, o tempo para a outra dimensão também deverá ser alterado. Isso parece um pouco inconveniente. Se isso pudesse ser automatizado, tenho certeza de que seria mais fácil de usar.

Na verdade, uma das razões pelas quais temos o Nano-Assist é porque eu pessoalmente queria melhorar apenas esses recursos. Os clientes das ciências da vida, que originalmente não eram usuários de LC, parecem pensar que o Nano-Assist é mais fácil de usar. É claro que adoraríamos incluir recursos como incrementação automática no LCsolution, onde os recursos são vinculados em função do tempo, mas teremos que considerar isso como um problema para versões futuras do LCsolution.

Além disso, você também usa um sistema de localização de placas AccuSpot MALDI, não é? Você tem alguma sugestão para fazer melhorias?

O volume da garrafa para a solução de matriz parece grande.

Provavelmente poderíamos torná-lo mais estreito se a solução da matriz fosse purgada regularmente e a manutenção fosse realizada. No entanto, a cristalização da secagem natural da matriz não mudaria, não importa quão estreita ou larga a tornemos. Isso pode ser inevitável, mas também achamos que há um problema de contrapressão. Estamos trabalhando em modificações para que não haja contrapressão.

Também quero perguntar como você decide quando usar o AccuSpot e quando usar MALDI-MS e LC/MS.

Usamos o AXIMA MALDI-TOF MS para analisar moléculas relativamente grandes e o AccuSpot quando queremos analisar mais detalhadamente com uma única valência. No caso de substâncias como glicopeptídeos, por exemplo, uma variedade de cadeias de açúcar pode se ligar aos peptídeos, então tentar visualizá-los com LC/MS pode se tornar muito complicado. Não só são variados, como têm múltiplas valências. Como eles eluem ao mesmo tempo, vários picos se sobrepõem. Se o MALDI-MS for usado para analisar tais substâncias, ele mostrará apenas os picos de massa das cadeias de açúcar. Portanto, para tais amostras, usamos AccuSpot e AXIMA.

Eu entendo.

Acho que o fato dos produtos Shimadzu serem compactos, economizarem espaço e consumirem menos solvente também é um ponto forte.

Eu suponho que sim. Pessoalmente, acho que outro fator, que é um ponto forte, é a atitude estrita do Japão em relação à manufatura. Mesmo ao listar especificações em catálogos de produtos, indicamos apenas valores muito conservadores.

Acho que Shimadzu é especialmente assim. Suspeito que você tenha padrões internos de triagem bastante rígidos. Portanto, mesmo que você tenha a tecnologia e possa fazer um produto, você demora muito para comercializá-lo. Mas suponho que isso seja importante para garantir a confiabilidade do instrumento.

Eu suponho que sim. Fazemos o possível para comercializar os produtos o mais rápido possível, levando em consideração a velocidade e outras especificações. Obrigado por disponibilizar o seu tempo conosco hoje.