Novo Conceito de Teste de Doping por Análises de Espectrometria de Massas Multiclasse

Você tem se concentrado no desenvolvimento de um novo método de teste de doping. Você poderia nos falar sobre o convencional em primeiro lugar?

Até agora, a análise Targeted, que identifica o composto-alvo automaticamente sob a condição de acordo com esse alvo, era predominante. Em uma grande competição internacional como os Jogos Olímpicos, esse método é muito útil para conduzir uma análise multicomponente altamente sensível e de alto rendimento para muitas substâncias dopantes. No entanto, como novas substâncias são adicionadas à Lista de Substâncias e Métodos Proibidos da Agência Mundial Antidopagem todos os anos, temos que classificá-las de acordo com as propriedades, conduzir a análise para cada classe de substância e realizar os testes por táticas de ondas humanas usando 50 unidades de instrumentos. Este tipo de análise representa 60 a 70% na análise de drogas tradicionais, por exemplo, drogas estimulantes e analgésicos narcóticos.

Que tipo de equipamento você usa para a análise acima mencionada?

O GC-MS Shimadzu. Embora usemos vários tipos de GC-MS de diferentes fornecedores em nosso laboratório, frequentemente usamos o GCMS-QP2010 Ultra da Shimadzu. A função que requer uma análise direcionada eficiente é alterar automaticamente a condição do instrumento e o íon-alvo de acordo com a substância-alvo em uma série de análises e identificá-la a partir do índice de retenções. Para esse propósito, a robustez do instrumento e a discussão com engenheiros para obter o potencial do instrumento tornam-se importantes. Além disso, confiamos nos produtos da Shimadzu em termos de desempenho de alto rendimento, estabilidade e suporte pós-venda. No entanto, temos nos concentrado na inovação técnica para romper as limitações dessa análise direcionada.

Você pode nos falar sobre a limitação de forma mais concreta?

A limitação da análise direcionada resulta do fato de termos que definir a substância-alvo e otimizar as condições de medição com antecedência. Por exemplo, substâncias não aprovadas chamadas drogas não regulamentadas e drogas sintéticas, que se tornaram um problema social, são um composto que modificou ligeiramente a estrutura das drogas existentes. Embora muitas vezes permaneçam como algum tipo de atividade farmacológica, eles são distribuídos no mercado clandestino sem avaliação regular de segurança. Além disso, uma vez que suas propriedades químicas e de massa são um pouco diferentes das existentes, elas são eliminadas como substâncias não direcionadas por testes de alta especificidade para drogas direcionadas. Portanto, esta é a razão pela qual podemos sentir falta deles. As pessoas, que auxiliam tal ato ilícito, simplesmente fazem cópia ou produtos similares e vendem em uma farmácia virtual na Internet. No entanto, uma vez encontrado um medicamento desconhecido não aprovado, os especialistas de laboratório devem tomar uma série de etapas para estabelecer o método de teste: primeiro, confirme sua segurança, em segundo lugar, procure um marcador de metabólito para um teste, conduzindo um estudo de aplicação ou estudo em humanos e, em terceiro lugar, avalie a precisão do novo teste. Essas etapas são semelhantes às da descoberta de medicamentos e levam muito tempo. Assim, outro medicamento estará disponível quando o novo método de teste for estabelecido. Como muitas vezes é expresso, jogamos um jogo de gato e rato.

Existem contramedidas?

Isso é desenvolver um método analítico para atender a uma ampla gama de substâncias sem limitar o alvo antecipadamente.

Você pode ser mais concreto?

A análise de destino pode ser expressada como "traço do componente de destino é detectado entre o lixo com alta sensibilidade". Isso significa que preparamos amostras para diminuir os outros compostos não direcionados (lixo) e tentamos detectar apenas a molécula alvo usando condições de medição específicas para ela. Em outras palavras, a droga não regulamentada e projetada é excluída como lixo. Assim, detectamos muitos tipos de compostos simultaneamente, tanto quanto possível, sob a condição de que a maioria dos compostos não seja perdida durante as medições e armazene toda a gama de traços de íons eletronicamente como banco de dados. Os picos de compostos conhecidos são identificados em tempo real aqui, mas também os desconhecidos são acumulados sem exclusão. No caso de compostos desconhecidos, não encontrados em indivíduos saudáveis de uma pessoa que não toma um medicamento, aparecem no perfil de pico certo, é altamente suspeito que seja o medicamento não aprovado retirado de fora do corpo e seu metabólito. Em seguida, conduzimos a análise da estrutura do composto de pico por espectrômetro de massa para descobrir uma possível droga dopante.

Que tipo de espectrômetro de massa você precisa para tal análise?

Uma ampla gama de compostos precisa ser coberta por esse tipo de análise. Portanto, usamos LC-MS, que pode detectar análises de dissociação de íons de vários estágios gerados por íons de produto com alta precisão de massa. O LMCS-IT-TOF da Shimadzu é o único a satisfazer tal condição entre os instrumentos que temos. Na análise Targeted usando GC-MS, os compostos alvo são extraídos, purificados e fracionados por solução ácida, neutra e alcalina e derivatizados de acordo com suas propriedades químicas. Em outras palavras, pode-se dizer que a molécula alvo considerável é determinada nesta fase. Por outro lado, usando LC, a amostra pode ser carregada sem uma preparação tão complicada e a resolução relativamente baixa para GC capilar pode ser coberta por análise de dissociação de íons em vários estágios com alta precisão de massa. Esse tipo de conceito, chamado de análise não direcionada, foi discutido há cerca de 10 anos. Naquela época, nós, incluindo fornecedores de massa, dificilmente tínhamos qualquer ideia de usar o TOFMS para triagem de drogas porque era usado principalmente para análise de biopolímeros. Ultimamente, LC-TOFMS é reconhecido como uma ferramenta eficaz para análise simultânea de vários componentes de pequenas moléculas contendo vários compostos desconhecidos. Atualmente todos podem usar o instrumento TOFMS para esta finalidade.

IT-TOFMS é uma tecnologia específica em nossa empresa. Como nossos engenheiros tiveram uma grande dificuldade em permitir que o íon aprisionado fosse transferido para o tubo de vôo, mantendo alta resolução e alta precisão ao mesmo tempo. Estamos muito satisfeitos em saber que a tecnologia é muito útil para sua pesquisa. Existem outras questões que você está enfrentando?

É um biopolímero, especialmente hormônios glicoproteicos. A eritropoietina (EPO), uma hormona estimulante que classifica as células estaminais hematopoiéticas em glóbulos vermelhos, é particularmente bem conhecida. Sua droga de proteína recombinante é usada como remédio para anemia nefrogênica. Às vezes, é usado como droga de doping para melhorar o desempenho de resistência, aumentando a hemoglobina, mas é difícil distinguir entre a proteína natural que é secretada no corpo humano e a droga de proteína recombinante.

Como você distingue?

Em geral, utiliza-se o método de imunoensaio ou western blotting. Prepare um anticorpo ligado a um hormônio glicoproteico específico e ligue um reagente de marcação para gerar fluorescência ou quimioluminescência no momento da ligação do anticorpo ao hormônio alvo, para que possamos medir quantitativamente a abundância do hormônio glicoproteico. Como determinamos qual hormônio glicoproteico a ser observado com antecedência, esse também é um tipo de análise direcionada. Um método imunológico é necessário para um alvo. Usamos uma amostra de urina para triagem de EPO e leva de 48 a 72 horas. Assim, realizamos o teste de triagem de sangue para todos ou atletas inscritos antes da competição e apreendemos o número de hemoglobina, glóbulos vermelhos e a proporção de glóbulos vermelhos formados por explosão. Com base nesse resultado, os atletas que apresentam achado analítico adverso são testados posteriormente em western blotting. No entanto, vimos alguns casos não identificados; o resultado do exame de sangue parece ser aparentemente suspeito, apesar do perfil eletroforese da EPO contida na urina diferir do padrão de referência.

Por que isso aconteceu?

A EPO é uma das drogas de proteína recombinante mais importantes nos círculos médicos e farmacêuticos. Depois que a patente da primeira geração, que foi colocada em prática pela primeira vez no mundo, expirou em meados do ano 2000, muitos produtos similares, os chamados biossimilares com estruturas diferentes, estavam disponíveis em todo o mundo. No caso não identificado, entendeu-se que a EPO recombinante foi reconhecida como a natureza análoga da EPO, que possui características diferentes na eletroforese na imunidade. A droga de proteína recombinante é produzida no cultivo da célula CHO transgênica, para a qual a proteína-alvo codifica a transferência do gene. Este método pode sintetizar a glicoproteína, cuja sequência de aminoácidos da proteína central é exatamente a mesma da proteína alvo, no entanto, a estrutura do carboidrato não pode ser controlada, porque não é regulada diretamente pelo gene. A estrutura do carboidrato da glicoproteína recombinante depende de uma glicosiltransferase utilizável e da proporção existente de monossacarídeo na condição de cultura. Assim podemos estimar facilmente que a diferença entre a EPO de primeira geração e seu biossimilar está em seu carboidrato. Na verdade, nossa pesquisa nos últimos anos verifica o seguinte; 1) a primeira geração e seu biossimilar têm a mesma sequência de aminoácidos da proteína central e o local de ligação do glicano, 2) há uma grande diferença entre a estrutura da antena, a estrutura do terminal e a proporção de monossacarídeo no glicano total e 3) a diferença entre a primeira geração da EPO e seu biossimilar no carboidrato, conforme mencionado acima, é consistente com a diferença daqueles na propriedade elétrica estimada pelos resultados da eletroforese de focalização isoelétrica.

Você usa espectrômetro de massa para essa pesquisa?

Sim. Utilizamos LCMS-IT-TOF Shimadzu conforme explicado anteriormente e Ressonância AXIMA, que adota MALDI como fonte de íons e detecção por IT-TOFMS. Muitas empresas farmacêuticas pesquisaram seus produtos de EPO e relataram sobre eles. Nosso objetivo é analisar as glicoproteínas e seus biossimilares proibidos pela Agência Mundial Antidopagem (WADA), dentre as glicoproteínas recombinantes que vêm sendo distribuídas no mercado. Portanto, precisamos pesquisar a característica de cada glicoproteína alvo. Para fazer isso, não identificando e distinguindo o isômero geométrico virtualmente, gostaríamos de confirmar a estrutura do carboidrato diretamente dos espectros MSn CID de vários estágios. Nossa abordagem é bastante ortodoxa. Não usamos método especial. A glicoproteína é digerida pela tripsina no primeiro estágio, em segundo lugar, o glicano ligado a N é clivado por PNGaseF da proteína central e, assim, obtemos digeridos que consistem em três grupos, como glicano ligado a O curto de ligação ao glicopeptídeo, peptídeo tríptico e glicano ligado a N. Finalmente, conduzimos a análise de MS para essas amostras. LCMS-IT-TOF e AXIMA Ressonance podem analisar a estrutura da proteína central, o local de ligação do glicano e a proporção de monossacarídeos de todo o carboidrato de ligação, depois que o glicano ligado a N é extraído como hidrazona. Tem sido amplamente relatado que a bioatividade dos hormônios glicoprotéicos depende da estrutura da antena, da estrutura do terminal e do conteúdo de ácido siálico, que precisa ser analisado por meio de várias enzimas de restrição e do complicado processo de extração em geral. No entanto, pudemos verificar que o sítio de ligação do glicano ligado a o, mesmo em digeridos com tripsina que contém vários resíduos de serina como candidatos ao sítio de ligação, pode ser identificado por medição CID MSn(n>3) em vários estágios.

Sim, a quantidade de dados é esmagadora. Do vasto número de resultados, posso perceber isso é um produto de trabalho árduo por você e sua equipe. Bem, com base na sua explicação até agora, se o sistema de detecção for IT-TOFMS, o ESI ou o MALDI podem fazer esse tipo de análise. Isso é correto?

Não. Nosso laboratório usa cerca de dez instrumentos de MS. No entanto, não há instrumento que seja igual. Cada instrumento tem uma óptica de íon diferente, fonte de íon e front end. Nós os usamos dependendo da finalidade e verificamos um método com vários instrumentos. Ao contrário de uma pesquisa fundamental, o desenvolvimento do método de teste é uma abordagem de transferência de tecnologia, ou seja, sua intenção é compartilhar esse método com outros institutos do mundo. No entanto, nem sempre é verdade que nossas contrapartes têm o mesmo ESI ou MALDI que nós. Embora seja difícil para você perceber, as intensidades de sinal relativas de alguns peptídeos ou glicanos são diferentes nos espectros de MS adquiridos por LC- e MALDI-IT-TOFMS, mesmo se medirmos a mesma amostra. É claro que o padrão do espectro MS também se torna diferente. Com base nisso, tentamos buscar uma condição reprodutível para poder detectar nas várias plataformas, porque não podemos chamar um método para realizar com o único instrumento especial do mundo como "padrão".

Exatamente.

Conhecemos alguns casos em que o peptídeo digerido com tripsina, cuja intensidade de sinal é relativamente alta em uma medição de glicoproteína original em LC-MS, não é detectado no experimento MALDI-MS e vice-versa. Isso acontece muito quando esse peptídeo inclui vários aminoácidos básicos ou quando a sensibilidade de detecção de digestores de tripsina é dependente das características de ionização. Portanto, analisar um pico com alta intensidade de sinal não significa que sempre podemos obter um resultado estável e sensível. Fornecer esse tipo de informação negativa é importante para melhorar o método de teste de doping e alcançar sua padronização.

Eu vejo. Considerando quando outros institutos no exterior usarão o método, em termos de validação, você precisa de dois espectrômetros de massa de ionização. Eu entendo muito bem. Caso a análise seja realizada pelos vários institutos, o nível de habilidade do operador afeta o teste?

Esse é o ponto que esperamos para a espectrometria de massa, em que pensamos ser menos provável de acontecer. Também é ótimo para nós reconhecer visualmente a precisão do resultado. Quando o teste não vai bem, podemos descobrir a parte falsa olhando o espectro. Outro mérito é que podemos realizar análises multicomponentes de uma só vez e prontamente. Existe possibilidade não apenas em LC-MS, mas também em GC-MS neste tipo de análise. Por exemplo, no caso da análise metabolômica que está se popularizando recentemente, como o ESI e o MALDI mencionados acima, seus métodos de ionização são diferentes, de modo que é útil para a análise de hidrocarbonetos e esteróides, difíceis de serem detectados por LC-MS. Antigamente, escrevíamos programas de macro para processamento de dados e relatórios por nós mesmos para automatizar a análise simultânea de vários componentes. Graças aos seus esforços para atender ao pedido que fizemos, podemos personalizar por nós mesmos até certo ponto e agora ficou mais amigável ao cliente, embora demorasse muito. (risos) No futuro, seria mais fácil de usar se você oferecesse suporte a um software evolucionário que permitisse armazenar e atualizar dados importantes de novos compostos cuja amostra padrão não está disponível. Isso ajudará a espectrometria de massa a expandir o uso mais amplo como equipamento de uso geral.

Isso é exatamente certo. Agora estamos ativos em fornecer a condição de análise de acordo com a finalidade, o que chamamos de Method Package, e desenvolvendo o banco de dados para identificação.

Multiplex também é necessário. Não podemos nos dar ao luxo de trocar de equipamento toda vez que os compostos-alvo mudam. A este respeito, o espectrômetro de massa que nos permite realizar muitas análises apenas mudando as condições é muito atraente.

Muito obrigado por ter uma grande expectativa para o espectrômetro de massa. Existe alguma coisa que você não está satisfeito?

Bem, a princípio é a sensibilidade. A quantidade de urina coletada no teste de doping atual é de 70mL a 90mL no máximo. Ou seja, a sensibilidade do instrumento MS deve ser melhorada 100 vezes. Em segundo lugar, o preço é o problema. Em uma competição internacional, um grande número de amostras deve ser manuseado em pouco tempo, de modo que a introdução do espectrômetro de massa seria um grande investimento.

Finalmente, gostaríamos de perguntar a você a visão para o futuro teste de doping.

Como mencionado até agora, muitas drogas são produzidas uma após a outra e há muitos usuários dessas drogas. Desde que a Internet removeu a barreira da informação, a expansão de novos medicamentos foi acelerada. Nós, especialistas em laboratório, ficamos para trás porque garantir a credibilidade e a segurança vem em primeiro lugar. Portanto, acredito que pretendemos encurtar a pesquisa ao introduzir ativamente as outras tecnologias utilizáveis desenvolvidas em vários campos. Na pesquisa em andamento de glicoproteínas, como mencionei anteriormente, o nível de pesquisa do Japão é muito alto e existem muitas tecnologias únicas neste campo. Infelizmente, a maioria dos laboratórios ocidentais de controle de doping não os introduziu. No entanto, acreditamos que eles serão um avanço para o teste de glicoproteína em um futuro próximo, que agora se aproxima de um impasse. Mesmo que as coisas que podemos fazer sejam limitadas, gostaríamos que o mundo conhecesse as tecnologias existentes feitas no Japão e contribuísse para o desenvolvimento do esporte legítimo, mantendo o problema de doping no mínimo.

Muito obrigado por poupar seu precioso tempo para esta entrevista. É muito útil para nós.

No Laboratório de Pesquisa Antidopagem do Centro de Análise Química do Japão, nossos principais produtos, como GCMS-QP2010 Ultra, LCMS-IT-TOF e AXIMA Resonance, apóiam suas pesquisas diárias. Por meio desta entrevista, aprendi que até mesmo o problema causado pela diferença de ionização e sistema de detecção, que os engenheiros de instrumentos tendem a ser negligenciados, é refletido em suas pesquisas. Fiquei tão impressionado que tal atitude vem de sua forte crença na expansão dos esportes legítimos e na contribuição dos resultados da pesquisa para a sociedade. Para maximizar a vantagem de ter uma série de vários instrumentos analíticos, gostaríamos de continuar a fornecer melhores soluções aos nossos clientes, respondendo às suas solicitações, como ouvi hoje.